3-10 توالی یابی…………………………….. 56

3-11 انتقال پلاسمید pET-32a (+) حاوی ژن هدف به باکتری BL21 (DE3)……..

3-12 تحریک بیان ژن هدف……………………………… 56

3-13 استخراج پروتئین از باکتری…………………………….. 57

3-14 الکتروفورز پروتئینها به روش SDS-PAGE……………..

3-14-1 مراحل بستن ژل به صورت زیر انجام شد……………..59

3-15 دات بلات……………………………… 61

3-16 محلولها و بافرها…………………………… 62

3-16-1 بافر شستشو یا محلول TBS…………………………….

3-16-2 محلول بلوکه کننده…………………………… 62

3-16-3 بافر شستشو یا محلول TBS-T……………………………..

3-16-4 آنتیبادی اولیه……………………………. 62

3-16-5 آنتیبادی ثانویه……………………………. 62

3-16-6 روش تهیه محلول رنگ آمیزی DAB…………………..

3-17 خالص سازی پروتئین…………………………….64

3-18 آماده سازی آنتی ژن ایمنی زا برای تزریق به مرغ………………….. 64

3-19 ایمنی زائی مرغ‌ها جهت تولید آنتی بادی اختصاصی……………… 65

3-19-1 تزریق اولیه…………………………… 65

3-19-2 تزریق‌های ثانویه  (Booster injection)……………………………. 66

3-20 جمع آوری و ذخیره تخم مرغ……………………………. 66

3-21 جداسازی IgY با بهره گرفتن از روش پلی اتیلن گلایکول 14700……………. 66

3-22 بررسی IgY به روش الکتروفورز SDS-PAGE و دات بلات……………… 67

4 نتایج و بحث……………………………… 67

4-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA……………………………..

4-2 تایید آلودگی نمونه‌های بیوپسی…………………………….. 69

4-3 تعیین کمیت و کیفیت DNA……………………………..

4-4 بررسی محصولات PCR……………………………..

4-5 خالص سازی محصول PCR……………………………..

4-6 هضم PET32a (+) و ژن CagA……………………………..

4-7 کلونینگ ژن CagA در باکتری DH5α……………………………..

4-8 تأیید صحت قطعه کلونشده در pET32a (+)………………………….

4-9 نتایج کلونی PCR…………………………….

4-10 تایید نتایج کلونی PCR با بهره گرفتن از T7…………………………….

4-11 استخراج پلاسمید و انجام هضم آنزیمی…………………………….. 75

4-12 توالی یابی…………………………….. 76

4-13 آنالیز فیلوژنتیکی توالی آمینواسیدی CagA……………………………..

4-14 بیان ژن……………………………. 78

4-15 SDS-PAGE…………………………….

4-16 دات بلات……………………………… 79

4-18 تولید IgY ضد هلیکو باکتر پیلوری-CagA در زرده تخم مرغ………… 81

این مطلب را هم بخوانید :

5 نتیجه گیری و پیشنهادات……………………………… 85

چکیده:

هلیکوباکتر پیلوری شایع ترین پاتوژن گوارشی است که نیمی از مردم دنیا را آلوده ساخته و مهمترین علت بیماری‌های معده ای-روده ای از جمله گاستریک مزمن، زخم معده و دوازدهه، سرطان معده و لنفوما است.  ژن CagA (سیتوتوکسین مرتبط با ژن A) یکی مهمترین شاخص‌های بیماری زای این باکتری است.  در این مطالعه به منظور همانه سازی بخش‌های آنتی ژنیک ژن CagA و بررسی تولید IgY در زرده تخم مرغ در ابتدا بر اساس برنامه‌های بیوانفورماتیکی قطعه حاوی اپی‌توپ‌های اصلی ژن CagA به طول 996 جفت باز شناسائی شد سپس این قطعه به کمک PCR از ژنوم هلیکوباکتر پیلوری موجود در بیوپسی معده 30 بیمار مبتلا به این باکتری جدا شده و با بهره گرفتن از هضم آنزیمی به ناقل  pET32a و سپس به داخل میزبان‌های کلون سازی و بیانی وارد شد.  نتایج توالی یابی کلونیگ موفق ژن CagA را نشان داد و در نهایت ترکیب پروتئینی بدست آمده توسط روش SDS-PAGE و دات بلات تائید شد. در مرحله بعد ترکیب پروتئینی بدست آمده به 3 مرغ از نژاد HY-LINE تزریق شد. تخم مرغ‌ها به مدت 10 هفته جمع آوری شدند و IgY تولید شده در زرده تخم مرغ آنها با بهره گرفتن از روش SDS-PAGE بررسی و تائید شد.

فصل اول

1- مقدمه