دریای خزر، بزرگترین دریاچه جهان در شمال ایران و جنوب روسیه بین عرضهای جغرافیائی مذکور در ذیل واقع شده است. عرض شمال 33 و 36 (جنوبی ترین نقطه) تا 7 و 47 (شمالی ترین نقطه) و طول شرقی 43 و 46 (غربی ترین نقطه) تا 50 و 54 (شرقی ترین نقطه) (بریمانی،1355)

1-1-1-آب و هوای دریای خزر

آب و هوای دریای خزر دارای تغییراتی می باشد، در قسمت شمالی و سواحل آن در زمستان هوا بسیار سرد تا 38 درجه زیر صفر می رسد و قشر نسبتا کلفتی از یخ،

 آبهای حاشیه ساحلی و دلتاهای ولگا و اورال را می پوشاند. اما در جنوب به عکس شمال برف و سرمای شدید نادر است. کرانه های شمال و شرق دریا آب و هوای خشکی دارند میزان بارندگی سالانه در این قسمت بین 200-100 میلیمتر است. متوسط درجه حرارت در دی ماه بین هفت تا ده درجه زیر صفر می باشد و در تابستان گرم می شود. متوسط درجه حرارت در تیرماه 26-25 درجه می رسد و نمونه کاملی از آب و هوای بری در این قسمت حاکم است. در قسمت میانی دریا اعم از سواحل و اعماق، متوسط درجه حرارت در دیماه از پنج درجه زیر صفر تا پنج درجه بالای صفر است و درجه متوسط حرارت در تیرماه بین 26-25 درجه می باشد. میزان بارندگی سالانه در شرق و قسمت میانه دریا از 100 تا 140 میلیمتر است و نقطه مقابل آن در غرب تا 2000 میلیمتر بارندگی دارد. در کرانه های جنوبی دریای خزر دو نوع آب و هوا تشخیص داده شده است آب و هوای گرم و مرطوب در باختر و جنوب باختری که درجه حرارت متعادل و ریزش بارانهای بهاری و پائیزی از خصائص این نوع آب و هوا است و آب و هوای مدیترانه ای که در بخش خاوری کرانه های جنوبی دریای خزر وجود دارد. میزان بارندگی سالانه در بخش جنوبی دریای خزر از غرب به شرق متغیر است بطوریکه هر قدر از غرب به طرف شرق حرکت کنیم مقدار آن کاهش می یابد (بریمانی،1355).

این مطلب را هم بخوانید :

1-1-2- ماهیان دریای خزر

6-3- روش استخراج DNA ……………………………………………………………………………………………………..83

1-6-3- طرز تهیۀ محلول­های مورد نیاز برای استخراج DNA………………………………………………………..84

2-6-3- مراحل استخراج DNA …………………………………………………………………………………………………84

7-3- تعیین غلظت DNA با دستگاه اسپکتروفتومتر……………………………………………………………………….86

8-3- الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………..87

1-8-3- طرز تهیه ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………88

2-8-3- طرز تهیۀ بافر (1X)TBE……………………………………………………………………………………………….88

9-3- واکنش PCR ……………………………………………………………………………………………………………………89

1-9-3- اجزا واکنش PCR………………………………………………………………………………………………………….91

2-9-3- روش انجام واکنش PCR با آنزیم SmarTaq DNA Polymerase……………………………….93

10-3- واکنش LAMP………………………………………………………………………………………………………………94

1-10-3- روش انجام واکنشLAMP …………………………………………………………………………………………95

11-3- آلوده سازی سس مایونز با باكتری مورد نظر………………………………………………………………………..96

12-3- آلوده سازی سالاد سبزیجات با باكتری مورد نظر…………………………………………………………………..97

13-3- تهیه پورپلیت و شمارش باكتری­ها………………………………………………………………………………………98

1-13-3 تهیه رقت……………………………………………………………………………………………………………………..98

2-14-3- کشت سطحی………………………………………………………………………………………………………………99

2-14-3- کشت پورپلیت…………………………………………………………………………………………………………….99

3-13-3 شمارش باكتری­ها…………………………………………………………………………………………………………..99

فصل چهارم (نتایج)……………………………………………………………………………………………………………………100

1-4- رنگ آمیزی گرم از باكتری……………………………………………………………………………………………….101

2-4- نتایج کشت نمونه ها روی محیط اختصاصی shigella– salmonella agar………………………101

2-4- تست­های بیوشیمیایی……………………………………………………………………………………………………..102

1-3-4- تست اوره………………………………………………………………………………………………………………….102

2-3-4- تست سیمون سیترات…………………………………………………………………………………………………..103

3-3-4 تست TSI ……………………………………………………………………………………………………………………104

4-3-4 تست SIM……………………………………………………………………………………………………………………105

5-3-4 تست متیل رد ……………………………………………………………………………………………………………….106

4-4- استخراج DNA …………………………………………………………………………………………………………….107

5-4- PCR………………………………………………………………………………………………………………………………108

1-5-4- حد تشخیص PCR………………………………………………………………………………………………………109

6-4- LAMP ……………………………………………………………………………………………………………………….110

1-6-4 حد تشخیص LAMP………………………………………………………………………………………………….112

فصل پنجم (بحث)……………………………………………………………………………………………………………………113

نتیجه ­گیری………………………………………………………………………………………………………………………………..121

منابع و ماخذ……………………………………………………………………………………………………………………………..122

 

چكیده

سالمونلا باكتری گرم منفی، متحرك و باسیلی شكل است كه خصوصیات عمومی خانواده انتروباكتریاسه را دارا می‌باشد. سالمونلا و سروتیپ‌های آن منبع مهم آلودگی غذاهای انسانی و عامل پاتوژن بسیار قوی و بیماری­زا در انسان­هاست. امروزه بیش از 2450 سروتیپ سالمونلا شناسایی شده است كه برخی از این سروتیپ‌ها عامل بیماری‌هایی از قبیل تب تیفوئید و انتروكولیک در انسان می‌باشند. بیماری­های ناشی از این عامل یک معضل بزرگ بهداشتی در جهان به خصوص در کشورهای در حال توسعه از جمله کشور ما می باشد. بنابراین تشخیص سریع، دقیق و به موقع آن برای جلوگیری از اپیدمی و عوارض مخرب این باکتری ضروری به­نظر می­رسد.

روش­های مختلفی برای جداسازی باكتری سالمونلا از نمونه‌های محیطی وجود دارد كه شامل: روش‌های كشت سنتی و بیوشیمیایی، سرولوژیكی و مولكولی (از جمله PCR) است. تمام این روش­ها به زمان طولانی، تعداد زیاد باکتری در نمونه اولیه، تجهیزات گران­قیمت آزمایشگاهی و به افراد متخصص در این زمینه نیاز دارند.

هدف از این مطالعه بررسی کارایی روش نوین تشخیص مولکولی LAMP در تشخیص عامل عفونی سالمونلا تیفی می­باشد. بررسی نتایج در تشخیص مولکولی سالمونلاها نشان داد که روش LAMP روشی سریع، ارزان و اختصاصی است و به­جای دستگاه­های گران­قیمت PCR و برنامه چرخه حرارتی چند دمایی آن با بهره گرفتن از یک بلوك حرارتی بسیار ساده و ارزان و در یک دمای واحد 60 درجه سانتی­گراد و همچنین مشاهده کدورت حاصل از فرایند تکثیر ژن­ها در زمان كوتاه­تری به تشخیص اختصاصی این باكتری سالمونلا پرداخت.

این روش می تواند جهت تشخیص مولکولی سریع، دقیق و ارزان با كاربرد گسترده در آزمایشگاه­های تشخیصی و بخصوص تشخیص عوامل عفونی در آزمایشگاه­های مناطق محروم و آزمایشگاه­های سیار مورد استفاده قرار گیرد.

واژه های کلیدی : سالمونلا، تشخیص مولکولی، PCR، LAMP

مقدمه

اعضای جنس سالمونلا، باكتری گرم منفی، میله­ایی، بی­هوازی اختیاری و بدون اسپور هستند. از آنجا كه جایگاه اصلی و طبیعی این باكتری‌ها روده انسان و حیوانات می‌باشد اصطلاحاً آنها را باسیل‌های روده‌ای یا انتریک می‌نامند. از لحاظ شرایط رشد این میكروارگانیسم‌ها باكتری‌های انعطاف‌پذیری بوده و به آسانی با شرایط محیطی خود را هماهنگ می‌كنند این جنس از میكروارگانیسم‌ها به حرارت حساس‌اند. در درجه حرارت‌های پائین امكان بقای آنها بیشتر است .(Connie & Manuselis, 2000)

اكثر سروتیپ‌های سالمونلا پاتوژن‌های بالقوه برای انسان و بسیاری از حیوانات می‌باشند. این باكتری‌ها در دستگاه گوارش مهره‌داران اعم از pestanداران و پرندگان و خزندگان و ماهی‌ها سیطره پیدا كرده، بسته به سروتیپ، شرایط و عوامل متعدد میزبانی، بیماری­هایی با نشانه‌های گوناگون و عوارض متفاوت ایجاد می‌كنند .(Merchant & Pocker, 1983)از جمله باكتری­های روده­ایی­ هستند كه موجب بیماری تب تیفوئید(حصبه)، تب شبه حصبه و بیماری­های ناشی از مواد غذائی در انسان می­گردند(Jay et al., 2005).

بیماری­های ناشی از آلودگی مواد غذائی ناشی از سالمونلا را non typhoidal نامیده­اند. سالمونلا به­طور گسترده­­ایی در محیط زیست از قبیل آب، خاك و مدفوع حیوانات توزیع شده است (Cidrp, 2009). باكتری معمولاً از طریق مدفوع انسان و یا دام دفع شده و باعث آلودگی آب و غذا و محیط می‌گردد. مواد غذائی مانند گوشت، تخم­مرغ، مرغ، سس مایونز، سبزیجات و غیره ،از ناقل­های اولیه عفونت سالمونلا به انسان هستند(Dolye & Beuchat, 2007)..

   سالمونلای غیر­تیفوئیدی علت اصلی بیماری­های ناشی از مواد غذائی در سراسر جهان است. كه بر­آورد شده كه حدود 4/1 میلیون مورد در سال مورد عفونت غذائی سالمونلا قرار می­گیرند(Mead et al., 1999).

از این­رو شناخت و تشخیص به موقع سالمونلا از اهمیت خاصی برخوردار است. با ذكر تمامی این موارد به نظر می‌رسد تشخیص به موقع و كنترل باكتری از وظایف مهم آزمایشگاه‌های میكروب‌شناسی است. امروزه از 3 روش رایج به تشخیص باكتری می‌پردازند:

ـ روش‌های كشت سنتی و آزمایشات بیوشیمیایی.

ـ روش‌های سرولوژیكی.

ـ روش‌های مولكولی.

برای تشخیص استفاده از روش­های سنتی مبتنی بر محیط كشت قابل قبول است ولی وقت­گیر است و برای تایید جواب نهایی چند روز به­طول می­انجامد .(Andrews & Hammack, 2007) علاوه­بر این، روش­های ایمنولوژیک مانند الایزا وIMS نیز برای شناسائی سالمونلا توسه یافته­اند.

. (Mansfield & Forsythe, 2000 ; FAVRIN , 2001) با این­حال اختصایت كم و هزینه­ های بالا، استفاده ازین روش­ها را محدود كرده است. اخیرا روش­های مولكولی مانند PCR و real time PCR به­طور گسترده در شناسائی سالمونلا استفاده می­شوند كه روش­هایی كارآمد و حساس هستند.

Krascsenicsova et al., 2008) ; Eriksson & Aspan, 2007).

با این­حال این روش­ها نیازمند سیكل حرارتی اختصاصی و دستگاه­های گران­قیمت­اند. از­این­رو نیاز به یک روش دقیق، حساس، آسان و به­صرفه­تر است. در سال 200 یک گروه ژاپنی یک روش تشخیص مولكولی به نام LAMP را معرفی كردند .(Notomi et al., 2000)از آن زمان روش LAMP به عنوان یک روش اختصاصی، حساس و سریع برای شناسائی پاتوژن­های ناشی از مواد غذائی مورد استفاده است. یک روش ساده، بدون نیاز به سیكل حرارتی اختصاصی و دستگاه­های گران­قیمت و به آسانی قابل اجرا است(Hara-Kudo et al., 2005; Notomi et al., 2000).

هدف این تحقیق شناسائی باكتری سالمونلا تیفی در سالاد سبزیجات و سس مایونز آلوده با بهره گرفتن از روش LAMP، به­عنوان روشی سریع، حساس و اختصاصی می­باشد.

اهداف تحقیق در نگاه اجمالی

این مطلب را هم بخوانید :

1. طراحی و بهینه­سازی روش LAMP بر اساس ژن تهاجمی invA سالمونلا تیفی
2. تعیین حد حساسیت روش PCR و LAMP به روی ژن تهاجمی invA سالمونلا تیفی
3. مقایسه دو روش PCR و LAM

• مشخصات جنس سالمونلا

1-1-2- تاریخچه

در سال 1885 یک دامپزشك آمریكائی به نام دانیل المر سالمون برای اولین بار این باكتری را از خوك جدا كرد وآن را باسیلوس كلرا­سوئیس[1] نامید. در سال 1888 جرم دیگری توسط گارتنر از فردی كه در اثر گاستروانتریت ناشی از مصرف گوشت نپخته مرده بود جدا شد و آن­را باسیلوس انتریتیدیس نامید كه بعداً سالمونلا انتریتیدیس خوانده شد. در سال 1900 خواص این باكتری توسط فردی به نام لینیر به­طور رسمی تصویب گردید. از آنجا كه این ارگانیسم ها شبیه به باكتری های جدا شده توسط سالمون بودند، به همین جهت به افتخار كاشف اولیه این باكتری سالمونلا[2] نامیدند(Roumagnac et al., 2006).

در فاصله بین سال­های 1925ـ1900 بزرگ­ترین رویداد در كشف سرولوژیكی آنتی‌ژن‌های سوماتیک و فلاژلا در مورد گروه سالمونلا بوسیله لیگنیرز انجام شد. در سال 1926 تركیبات پادگنی سالمونلا طبقه‌بندی گردید و جدولی به نام جدول كافمن ـ وایت ایجاد شد. در حال حاضر این جدول دارای حدود 2500 سروتیپ است (Bhatia & Nabb , 1980) .

     سالمونلا بطور گسترده در طبیعت توزیع شده است مانند آب آلوده، خاك حاوی مدفوع حیوانات و غیره. به طور عمده این باكتری­ها در روده­ی حیوانات ساكن است و مخزن اصلی آلودگی مرغ، تخم مرغ، دام، حیوانات خانگی و خزندگان است(Cidrp, 2009).

2-1-2- خواص شكلی

اعضای جنس سالمونلا باكتری­های میله­ای شكل و اندازه­ آن 5-2 ´5/1-7 /. میكرون بوده است.گرم منفی، بدون اسپور و متعلق به خانواده­ی انتروباكتریاسه­اند (J. Antonio , 2009 ; Dolye & Beuchat, 2007) .. اكثر اعضای این جنس متحرك و با تاژه­ی پری­تریش­اند به­جز چند مورد استثناء مانند سالمونلا گالیناروم[3] و سالمونلا پولوروم[4] (et al., 2005 Hara-Kudo).

3-1-2- خواص بیوشیمیایی

اعضای این جنس قادر به تخمیر گلوكز بوده ولی از تخمیر ساكارز و لاكتوز نا­توانند. بیشتر انواع سالمونلا ها گلوكز، مالتوز، مانیتول، دولسیتول، دكسترین و سوربیتول را تخمیر می كنند و اسید و گاز بوجود می آورند. اكثر سویه­ها H2sرا از منبع سولفوری معدنی تولید كرده و تولید H2S یکی از واکنش های کلیدی در تشخیص سالمونلاها می­باشد. به استثنای سروتیپ تیفی[5] در بیشتر موارد جدا شده از گلوکز گاز ایجاد می­ کنند. در سیترات به عنوان تنها منبع كربن رشد می­كنند اما برخی از گونه ها مانند سالمونلاتیفی و سالمونلا پاراتیفی A سیترات منفی هستند Aksoy, 2004)). این باكتری اكسیداز منفی و كاتالاز مثبت بوده. از تولیدات این باكتری لیزین در كربوكسیلات، سولفات هیدروژن وارنیتین می‌باشد.

( Alcamo , 1997 ; Connie & Manuselis, 2000) .

کردند. دی پاسکال– ترسا و همکاران یک روش جداسازی HPLC و تشخیص آنلاین با آرایه دیودی اسپکتروسکوپی بعد از واکنش شیمیایی با پارا- دی متیل آمینو سینامان آلدئید (DMACA) را ارائه داده اند. استخراج ترکیبات فنلی در ماءالشعیرها نیز توسط استخراج مایع-مایع (LLE) با حلال های آلی مانند ان-هگزان، ایزواکتان، اتیل استات و استون/آب انجام شد. اسیدهای آلی در ماءالشعیر توسط بلکه و ایروین با یک رزین تبادل آنیون مورد بازیافت قرار گرفت و با تاثیر رزین بر متانول-BF3 به استرهای متیلی آنها تبدیل می شوند. در ضمن، استخراج فاز جامد (SPE) یک روش متداول و معمول مورد استفاده برای پیش غلظت و خالص سازی پیش از جداسازی HPLC ترکیبات فنلی در ا

نواع شراب می باشد، این روش استخراج در مورد ماءالشعیرها انجام نشده است. جداسازی ترکیبات فنلی در ماءالشعیر معمولا توسط کروماتوگرافی مایع معکوس که به

این مطلب را هم بخوانید :

پایان نامه درمورد جایگاه سند/:تسلیم در برابر سند

 دنبال آن آرایه ماورابنفش فوتودیود، فلوریمتری، الکتروشیمیایی و طیف سنجی جرمی قرار دارد، انجام می شود. روشی بر اساس استخراج فاز جامد و به دنبال آن جداسازی کروماتوگرافی مایع و تشخیص ماورابنفش به عنوان یک ابزار تحلیلی مفید برای کنترل کیفیت در صنعت تخمیر برای تعیین اسیدهای فنلی مانند اسید کافئیک، پارا-کوماریک، اسید گالیک، اسید جنتیسیک، فلوریک اسید و اسید سالیسیلیک و

 می‌شود. بر اساس مقادیر عناصر و نیز اندازه‌گیری‌های انجام شده پارامترهای مدل هر یک از اجزا بدست می‌آید. در این پایان‌نامه می‌خواهیم مدلسازی سیستم تحریک ژنراتور سنکرون را با استفاده مدل همه قسمت‌های سیستم و به صورت توزیع شده بدست آوریم. در واقع برای آنالیز دقیق و صحیح سیستم تحریک باید یک مدل کامل و با در نظر گرفتن جزییات از جمله اثر پوستی در نظر گرفت

1-2- بیان مسئله:

 

 

وظیفه اصلی سیستم تحریک تأمین جریان تحریک ماشین سنکرون است بعلاوه با کنترل ولتاژ تحریک وظیفه کنترل و حفاظت یک سیستم قدرت را بر عهده دارد. ]1[
برای تحریک ماشین‌های سنکرون روش‌های مختلفی وجود دارد ، این روش‌ها با پیشرفت تکنولوژی و گذشت زمان یکی پس از دیگری ابداع شده و برخی از این روش‌ها دارای معایبی بوده که باعث شده است به فکر تغییر سیستم و اصلاح وارتقاء آن‌ها بیفتیم. ]2[

سیستم تحریک با تغییر جریان dc سیم‌پیچ تحریک واقع بر روی رتور نیروی محرکه تولید شده ژنراتور را کنترل می‌کند وبا تغییر نیروی محرکه ژنراتور نه تنها ولتاژ خروجی 

این مطلب را هم بخوانید :

آیا تقاضای اندک باعث خواهد شد تا مایکروسافت تجارت فروش موبایل را کنار بگذارد؟

تنظیم می‌شود بلکه ضریب قدرت و دامنه جریان نیز کنترل می‌شود.

مهمترین اجرا سیستم تحریک]3[ ]4[:
1- تحریک کننده: تامین توان جریان مستقیم مورد نیاز سیم پیچ تحریک (بخش توان سیستم تحریک)