برای اطمینان از وجود قطعه مورد نظر در پلاسمید  ……………………………………………………….. 69

-۱۸ ۳- انتخاب یک یا دو كلون برای توالی یابی (برای حصول اطمینان

از توالی درست ژن)…………………………………………………………………………………………………. 69

-۱۹ ۳- پس از حصول اطمینان از توالی ژن، كلون مورد نظر برای بیان ژن

مورد استفاده قرار می گیرد…………………………………………………………………………………….. 69

۲۰-۳- خالص سازی (Purification) پروتئین های تولیدشده به فرم گنجیدگی های

درون سلولی(Inclusion body) تحت شرایط دناتوره کننده…………………………………………….. 70

۲۱-۳- حل کردن (Solubilization)و بازتاخوردگی ( Refolding) پروتئین های

تولیدشده به فرم گنجیدگی های درون سلولی (Inclusion body)…………………………………… 71

۲۲- ۳- اندازه گیری غلظت پروتئین نوترکیب  NcSAG1به روش لوری………………………… 73

۲۳-۳- ارزیابی پروتئین نوتركیب خالص شده و بازتاخورده با بهره گرفتن از

SDS-PAGE  و وسترن بلاتینگ(Western Blotting)……………………………………………………… 74

۲۴- ۳- آزمایش وسترن بلاتینگ پروتئین ها……………………………………………………………………… 75

1-24- ۳-  بلاتینگ ……………………………………………………………………………………………………….. 75

2-24-3- مسدود سازی سطح کاغذ (Blocking)………………………………………………………… 75

3-24- ۳- اضافه کردن سرم ضد نئوسپورا……………………………………………………………………. 76

4-24- ۳- اضافه کردن آنتی بادی کنژوگه……………………………………………………………………. 76

5-24- ۳- اضافه کردن محلول سوبسترا………………………………………………………………………… 76

۲۵- ۳- پوشاندن (Coating) ذرات لاتكس با آنتی ژن نوتركیب NcSAG1……………………. 77

۲۶- ۳- جمع آوری نمونه های سرم……………………………………………………………………………………. 78

۲۷-۳- انجام تست لاتكس آگلوتیناسیون LAT) )…………………………………………………………….. 78

۲۸-۳- انجام تست الایزا……………………………………………………………………………………………………….. 79

۲۹-۳- مقایسه ارزش تشخیصی تست لاتكس آگلوتیناسیون LAT) )

بر اساس آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 با تست الایزا ………………………………………………………. 79

عنوان                                                                                                                      صفحه

فصل چهارم: نتایج

۱-۴- تکثیر قسمتی از ژن NcSAG1 با روش PCR…………………………………………………………. 81

۲-۴- کلون کردن ژن NcSAG1 در پلاسمید pTZ57R/T………………………………………………. 82

۳-۴- استخراج پلاسمید از کلون 2163 E.coli GM حاوی قطعه ژنی مورد نظر

در پلاسمید pTZ57R/T………………………………………………………………………………………………………… 83

۴-۴- برش پلاسمید حاوی قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a  (کلون 2821)

با آنزیم ІІІ Hind …………………………………………………………………………………………………………………. 84

۵-۴- برش قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a  بریده شده با آنزیم ІІІ Hind، بوسیله

آنزیم NcoІ……………………………………………………………………………………………………………………………. 85

۶-۴- خالص سازی قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a  بریده شده با آنزیم های

ІІІ Hind و NcoІ…………………………………………………………………………………………………………………. 86

۷-۴- کلون کردن قطعه ژنی NcSAG1 بریده شده در پلاسمید pET-28a

بریده شده با همان آنزیم ها………………………………………………………………………………………………… 87

۸-۴- نتایج بیان پروتئین نوتركیب………………………………………………………………………………………. 88

۹-۴- نتایج خالص سازی پروتئین نوترکیب تولیدشده به فرم

گنجیدگی های درون سلولی……………………………………………………………………………………………….. 91

۱۰-۴- نتایج اندازه گیری غلظت پروتئین نوترکیب NcSAG1 به روش لوری……………….. 93

۱۱-۴- نتایج حاصل از وسترن بلاتینگ پروتئین نوترکیب خالص شده

تحت شرایط دناتوره کننده…………………………………………………………………………………………………… 94

۱۲-۴- نتایج حاصل از الکتروفورز و وسترن بلاتینگ پروتئین نوترکیب بازتاخورده………… 95

۱۳-۴- نتایج حاصل از تست لاتكس آگلوتیناسیون……………………………………………………………. 95

فصل پنجم: بحث

پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………. 103

فهرست منابع و مآخذ……………………………………………………………………………….. 104

مقدمه

نئوسپورا کانینوم تك یاخته اجباری داخل سلولی از شاخه آپی کمپلکسا ، اولین بار توسط برکاس و همكارانش (۱٩۸۴) توصیف شد. دوبی و همكاران (۱٩۸۸) این تک یاخته را برای اولین بار از سگ ها جدا و نامگذاری كردند (Dubey et al. 1988a,b) سپس مشخص شد كه میزبان نهائی نئوسپورا کانینوم، سگ است (Holmdahl and Mattsson 1996; Lindsay et al. 1995  Basso et al. 2001;).

نئوسپورورزیس از علل اصلی سقط جنین گاو است، از این رو با سقط ‌، مرده زائی، تولدگوساله ضعیف یا همراه با عفونت دائمی و كاهش تولید شیر ضررهای اقتصادی قابل توجهی ایجاد می كند. انتشار عفونت در گاو با انتقال تاكی زوئیت از مادر به جنین و یا با خوردن آب و غذائی آلوده به اووسیست انگل صورت می گیرد 1999, Trees et al. 1999; Romero et al. 2004) Dubey).

مطالعات انجام شده در برخی كشورها حاكی از این است كه ۴۲-۱۳ درصد جنین های سقط شده در گاوها به این انگل آلوده هستند (Dubey and Lindsay 1993; Dubey et al. 2006 ). نئوسپورا کانینوم علاوه بر گاو ، سایر گونه های اهلی چون اسب، گوسفند، بز، شتر، سگ، گربه و سگ سانان وحشی را آلوده می كند (Dubey 2003; Gondinm 2006 ).

نئوسپوروزیس انتشار جهانی داشته و از بسیاری از كشورهای جهان گزارش شده است، ایران نیز از این قائده مستثنی نیست. در بررسی آلودگی نئوسپورا کانینوم در گاوهای شیری سقط كرده، رزمی و همكاران (۲۰۰۶) اولین مورد سقط جنین گاوی را در مشهد گزارش كردند و ۱۸/۱۵درصد نمونه های سرمی گاوها در تست  IFAمثبت بودند

(et al. 2007; Sadrebazzaz et al. 2004  Razmi).

با توجه به گزارشاتی مبنی بر وجود آلودگی در گاوهای كشور و خسارات اقتصادی حاصله بر صنعت گاوداری، طراحی و ارزیابی تستهای تشخیصی حساس و اختصاصی كه توانایی تشخیص حیوانات آلوده را به منظور كنترل نئوسپورا کانینوم در سطح گله داشته باشند ضروری به نظر می رسد.

از زمان شناسایی نئوسپورا کانینوم تاكنون روش های تشخیصی زیادی برای شناسایی آلودگی دامها به این انگل ابداع شده است. از این میان می توان به روش های هیستوپاتولوژی، ایمونوهیستوشیمی، سرولوژی، مولكولی، كشت سلولی و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی اشاره نمو د

(2003 Dubey and Schares 2006 ; Dubey and Lindsay 1993; Dubey et al. 2006; Dubey )

تشخیص قطعی بر اساس آزمایش ایمونوهیستوشیمی بافتهای آلوده است. این روش معمولاﹰ برای تأیید سایر روشها و نیز برای تفکیک نئوسپورا کانینوم از توکسوپلاسما گندئی استفاده شده اما روشی وقت گیر بوده و تفسیر نتایج آن مشکل است

(Dubey and Lindsay 1993; Jones 1996; Romand et al. 1998; Dubey and ;Schares 2006; Dubey 2003).

تشخیص آلودگی عمدتا با روش های سرولوژیکی، به عنوان ابزار مهمی برای بررسی های کلینیکی و اپیدمیولوژیکی، انجام می شود (et al. 2007 Silva).

آزمایشات سرولوژیک دارای این مزیت هستند که قبل از مرگ دام قابل انجام بوده و اطلاعات کافی در مورد مرحله آلودگی فراهم می سازند (Dubey and Schares 2006). از آنجایی که تنها نشانه در معرض قرار گرفتن با نئوسپورا کانینوم، حضور آنتی بادی های اختصاصی در سرم گاو است، روش های مختلف سرولوژیک برای تشخیص آنتی بادی به کار گرفته شده که شامل  IFAT، انواع الایزا وDAT هستند (et al. 1997 Williams  Romand et al. 1998;  Packham et al. 1998; Paré et al. 1995a;  Lally et al. 1996;  Conrad et al. 1993a;   Björkman and Lunden 1998; ). در این روشها از تاکی زوئیت کامل یا آنتی ژن های مشتق شده از تاکی زوئیت استفاده می شود که به علت واکنش متقاطع با سایر انگلهای مربوطه مانند توکسوپلاسما گندئی باعث واکنش مثبت کاذب می شود

(et al. 1993b; Dubey and Lindsay 1993 Conrad et al. 2003; ; 1999 Chahan Bjorkman and Uggla ). همچنین به علت نیاز این آزمایشات به استفاده از مقادیر زیاد آنتی ژنهای مشتق شده از کشت سلولی، اغلب تهیه آنتی ژن و استاندارد کردن آن مشکل است و به دلیل تفاوت در میزان بقایای سلول میزبان بر اختصاصیت و تکرارپذیری نتایج تست تاثیر می گذارد (Lally et al. 1996;  Jiang et al. 2008;  al. 1996;   et Baszler). بنابراین ضروری است که تست تشخیصی مطمئن، حساس و اختصاصی با بهره گرفتن از آنتی ژن های اختصاصی نئوسپورا کانینوم طراحی شود.

آنتی ژن های نوترکیب درمقایسه با آنتی ژن های کامل، مزایای بیشتری دارند زیرا اولا به آسانی درحجم زیاد تهیه می شوند و ثانیا به راحتی برای آزمایشات تشخیصی استاندارد می شوند. بنابراین با به كارگیری این آنتی ژن ها، نیازی به آنتی ژن های مشتق شده از کشت سلولی نیست (et al. 2003; Louie et al. 1997  Chahan).

تاکنون چندین آنتی ژن نئوسپورا کانینوم شناسایی شده اند که اغلب آنها شامل
پروتئین هایی هستند که روی سطح مراحل مهاجم انگل ظاهر می شوند مانند  NcSAG1و  NcSRS2که از آنتی ژن های سطحی ایمونودومینانت اصلی هستند
(immunodominant surface antigens  major). علاوه بر این ، آنتی ژن هایی نیز هستند که بطور موقتی روی سطح تاکی زوئیت های انگل ظاهر می شوند مانند محتویات میکرونم، راپتری و گرانولهای متراکم. این ها ارگانل های ترشحی در ناحیه قدامی مراحل مهاجم انگل هستند و در واکنشهای فیزیکی مستقیم بین انگل و سلول میزبان نقش دارند
( Soldati et al. 2001; Sonda et al. 2000et al. 1998; Nishikawa et al. 2001a;b;  Liddell Lally et al. 1997;  Boothroyd 2000; Dubremetz et al. 1998; Hemphill et 1997 Black and ).

اگرچه NcSAG1 و  NcSRS2 بطور واضح با همتاهای خود در توکسوپلاسما گندئی (TgSAG1 و TgSRS2) هومولوگ هستند اما میزان تشابه توالی به اندازه ای نیست

این مطلب را هم بخوانید :

پایان نامه تعارضات زناشویی:راهبردهای حل تعارض

 که باعث بروز واکنش متقاطع شود، از این رو به عنوان مارکرهای تشخیصی عالی برای تمایز موثر بین نئوسپورا کانینوم و توکسوپلاسما گندئی قابل استفاده هستند (Howe et al. 1998). همچنین پاسخهای ایمنی القاء شده توسط این آنتی ژن های سطحی، آنها را به مارکرهای ایده آل برای تشخیص سرولوژیکی آلودگی به نئوسپورا کانینوم و تهیه واکسن تبدیل كرده است

Chahan et al. 2003; Gaturaga et al. 2005; Howe et al. 1998; Liu et al. 2007; Pinitkiatisakul et al. 2005 ) Ahn et al. 2003; ).

تست الایزا با بهره گرفتن از آنتی ژن های tNcSRS2 -GST و GST-NcSAG1t برای تشخیص نئوسپورا کانینوم طراحی و مورد استفاده قرار گرفته است و نتایج نشان می دهد که این تست، حساسیت و اختصاصیت بالایی دارد و واکنش متقاطعی با سرم مثبت  توکسوپلاسما گندئی ندارد Liu et al. 2007 ; Pinitkiatisakul et al. 2005; Hemphill et al. 1997; l Gaturaga et al. 2005;  Ahn et al. 2003; ).

اكثر تستهای تشخیصی به صورت كیت های تجاری وارداتی، پرهزینه و وقت گیرهستند و به مواد و ابزارخاصی نیز نیاز دارند که آن ها را برای کاربرد فیلدی و کلینیکی نامناسب می سازند (et al. 2005  Chahan et al. 2003; Liao )، از این رو طراحی و ارزیابی تست تشخیصی با حساسیت و اختصاصیت بالا كه به ابزار اختصاصی پیشرفته نیاز نداشته باشد و در عین حال سریع و آسان انجام شود ضروری است.

تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT)) یکی از راحت ترین تستهای تشخیصی است و در حال حاضر به عنوان یک تست تجاری در دسترس برای تشخیص توکسوپلاسما گندئی استفاده می شود ( et al. 2004  Huang). در تحقیقی از تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT)) با  آنتی ژن نوترکیب TgMIC3 برای تشخیص سرولوژیکی توکسوپلاسما گندئی استفاده شده که به علت اختصاصیت بالا ، کاربرد سریع و ساده،کم هزینه بودن و مناسب  برای استاندارد شدن، روش تشخیصی مناسبی گزارش شده است (Jiang et al. 2008). تاکنون از این تست برای تشخیص نئوسپورا کانینوم استفاده نشده ولی از آنجایی که TgMIC3 هومولوگ NcMIC3 است و با سرم گاو آلوده به نئوسپورا کانینوم واکنش متقاطع می دهد ) Jiang et al. 2008)، در تحقیق حاضر از NcSAG1 نوترکیب به عنوان آنتی ژن برای تشخیص آنتی بادی ضد نئوسپورا کانینوم در گاو استفاده شد (2005 et al.  Chahan et al. 2003; Liao).

هدف از این تحقیق طراحی و استاندارد کردن تست لاتكس آگلوتیناسیون LAT)) بر اساس آنتی ژن نوترکیب   NcSAG1 برای تشخیص سرولوژیکی نئوسپورا کانینوم و مقایسه ی ارزش تشخیصی این تست با کیت تجاری الایزا است.

کلیات

1-2- تاریخچه

 نئوسپورا کانینوم (Neospora caninum)  تک یاخته داخل سلولی اجباری از شاخه آپی کمپلکسا (Apicomplexa) و بسیار شبیه توکسوپلاسما گندئی (Toxoplasma gondii) است. در ابتدا در سگ های نروژی دارای علائم عصبی مانند آنسفالیت و فلجی اندام های حركتی انگلی شبیه به توكسوپلاسما گندئی گزارش شد (Bjerkas et al. 1984). سپس انگل در سال 1987 در گوساله های مبتلا به میلوآنسفالیت مشاهده گردید ( Anderson et al. 2000).

در یک مطالعه گذشته نگر مقاطع آسیب شناسی، نشانه های بالینی و اطلاعات آزمایشگاهی ثبت شده از 23 سگ نروژی كه در آنها یک بیماری مانند توكسوپلاسموزیس تشخیص داده شده بود را مورد بررسی و با میكروسكوپ نوری و الكترونی مورد مطالعه قرار دادند. در 13 مورد عامل بیماری توكسوپلاسما گندئی تشخیص داده شد، اما در 10 مورد دیگر از سگ ها یک جنس جدید به نام نئوسپورا و گونه ای به نام نئوسپورا كانینوم كه از نظر ساختمانی و آنتی ژنی متفاوت از توكسوپلاسما گندئی بود، تشخیص داده شد. به این دلیل این انگل نئوسپورا نام گرفت كه از لحاظ سیر تكاملی و ریخت شناسی مشابه با